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親和層析純化的抗HRP及其耦聯(lián)物的抗體可以用來檢測HRP或者放大含有HRP試劑的效果。哺乳動物細(xì)胞的免疫染色中。因此這個抗體的優(yōu)勢就是可以降低背景。由于抗HRP抗體不識別內(nèi)源性的過氧化物酶的類似酶。A minomethylcoumarinAcetatAMCA
耦聯(lián)的AMCA 吸收光波長最大為350nm發(fā)熒光則為450nm對于熒光顯微鏡來說。用紫外濾板來觀察。由于AMCA 信號相對較弱，AMCA 可以用汞燈來激發(fā)。單標(biāo)實(shí)驗(yàn)中不推薦使用AMCA AMCA 和熒光素的熒光波長只有很小的重疊范圍，而和發(fā)出長波長熒光的熒光基團(tuán)沒有或者只有極少的重疊，因此它最常用于多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，比如免疫熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀。由于人眼不能很好的檢測藍(lán)色熒光，多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中，AMCA 耦聯(lián)的二抗應(yīng)當(dāng)被用于檢測大量的抗原。AMCA 和熒光素一樣很快淬滅，使用抗淬滅劑可以減輕。如果使用在流式細(xì)胞儀中，AMCA 可以用汞燈或者水冷卻的氬光燈激發(fā)，因?yàn)樗l(fā)出的光線是光譜的紫外區(qū)。
FluoresceinIsothiocyanFITC
耦聯(lián)的熒光素基團(tuán)吸收的最大波長為492nm發(fā)射的最大波長為520nm由于FITC被使用了很長時間而且產(chǎn)量很大。因此要和抗淬滅劑一起使用。DTA F熒光素的一個衍生物，F(xiàn)ITC被廣泛應(yīng)用。熒光素的最大缺點(diǎn)是淬滅快。激發(fā)和發(fā)射波長均和FITC相同。當(dāng)和鏈霉親合素耦聯(lián)時，因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度上有明顯的區(qū)別，最好不使用FITC而使用DTA F
CyanindyeCy2.Cy5 Cy3.
Cy2耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)波長為492nm發(fā)光為波長510nm綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC光下更穩(wěn)定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑。染色片貯存后會導(dǎo)致熒光微弱和擴(kuò)散。因?yàn)檫@種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng)。
背景更弱。熒光顯微鏡的Cy3耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)光的最大波長為550nm最強(qiáng)發(fā)射光為570nm因?yàn)榧ぐl(fā)光和發(fā)射光波長很接近PITC,更穩(wěn)定。Cy3和Cy5比其他熒光團(tuán)探針要更亮。熒光顯微鏡中，可使用和PITC一樣的濾波片。
氦氖燈（543nm或者汞燈（546nm下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標(biāo)。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。 Cy3氬光燈（514nm或528nm下可以被激發(fā)出50％的光強(qiáng)。
Cy5耦聯(lián)基團(tuán)的激發(fā)波長最大650nm發(fā)光波長最大670nm氪氬燈（647nm下它可被激發(fā)出98％的熒光。而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時采用具有合適激發(fā)光和遠(yuǎn)紅外檢測器的共聚焦顯微鏡。水相封片劑中應(yīng)當(dāng)加入抗淬滅劑。使用保守的外表熒光顯微鏡時，氦氖燈下（633nm為63％。Cy5可以和很多其他熒光基團(tuán)一起用在多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中。由于它最大發(fā)射波長在670nmCy5很難用裸眼觀察。不推薦使用Cy5
TetramethylRhodaminIsothiocyanPITC
TexaRedP RhodaminRed-XRRX.
RRX尤其有用，可以和Cy2或者FITC和Cy5一起使用，因?yàn)镽RX發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，而且和這兩者覆蓋都很少。氪氬燈激發(fā)光為488nm598nm和647nm分別是Cy2FITC,使用RRX和P可以得到更好的顏色區(qū)分。使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)時。這些若丹明的衍生物耦聯(lián)基團(tuán)具有不同的吸收波長 550,570,596nm和最大發(fā)射波長（570,590,620nm盡管PITC經(jīng)常和FITC一起在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中使用。RRX和Cy5理想激發(fā)波長。因?yàn)镕ITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發(fā),流式細(xì)胞儀中用FITC作雙標(biāo)，另一種用藻紅蛋白（PE耦聯(lián)基團(tuán)要比若丹明好，
總結(jié)下來
熒光團(tuán)探針的選擇有兩個重要標(biāo)準(zhǔn)：
A. 熒光顯微鏡的光源，濾片，檢測系統(tǒng)。
B. 多標(biāo)記中對探針色彩區(qū)分程度的要求。
例如，若丹明紅-X (RRX)和德克薩斯紅(TR)熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區(qū)別明顯。
C. 靈敏度。比如，Cy3和Cy5就比其他的熒光團(tuán)探針要亮。
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