研究過(guò)程與方法
實(shí)驗(yàn)首先利用免疫染色法了解細(xì)胞內(nèi)胞器的分布情形。免疫染色是利用抗原及抗體之間的專(zhuān)一結(jié)合特性,使抗體跟抗原結(jié)合,若將螢光物質(zhì)標(biāo)定在抗體上,即可以利用螢光顯微鏡觀察抗原所在的位置。配合其他已知的標(biāo)定分子(如DNA位在細(xì)胞核,Golgin-245蛋白質(zhì)位在高基氏體)我們可順利觀察實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)所在的胞器位置,探討蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸情形。
實(shí)驗(yàn)是以螢光標(biāo)定的霍亂毒素次單元B(CTB-594nm)及運(yùn)鐵蛋白質(zhì)(Tf-488nm),了解細(xì)胞外的分子是透過(guò)內(nèi)胞作用由細(xì)胞膜運(yùn)送到高基氏體。此二種蛋白質(zhì)的不同之處是運(yùn)鐵蛋白質(zhì)的胞飲作用需透過(guò)包涵素外衣囊袋(clathrin)的三角架結(jié)構(gòu)運(yùn)送,而霍亂毒素次單元?jiǎng)t大都不需透過(guò)包涵素外衣囊袋運(yùn)送。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,直接加入螢光標(biāo)定的霍亂毒素次單元B及運(yùn)鐵蛋白質(zhì),皆會(huì)受細(xì)胞自動(dòng)胞飲進(jìn)入細(xì)胞,我們只需控制蛋白質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程的時(shí)間即可觀察到這些蛋白質(zhì)會(huì)被運(yùn)送到所預(yù)期的標(biāo)的地(例如:endosome、Golgi、ER)。
實(shí)驗(yàn)是利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法,將外源基因送至細(xì)胞中,使細(xì)胞表現(xiàn)該基因。常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染法有【磷酸鈣】、【電穿孔法】、【脂小體】和【顯微注射】等。此次實(shí)驗(yàn)是以脂小體為媒介將ARL1的突變株ARL1QL及VSVG-GFP轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。將VSVG-GFP質(zhì)體轉(zhuǎn)至細(xì)胞內(nèi)則該外生性VSVG-GFP會(huì)運(yùn)送至高基氏體后,再運(yùn)送到細(xì)胞膜,因此透過(guò)VSVG-GFP這種毒蛋白質(zhì)可以了解外釋作用。而我們同時(shí)送入的是一種會(huì)參與調(diào)控囊泡運(yùn)輸?shù)奶厥獾鞍踪|(zhì)分子ARL1QL,觀察ARL1QL對(duì)于VSVG-GFP運(yùn)輸過(guò)程的調(diào)節(jié)作用。
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